Science | 更小的基因编辑工具！巨型噬菌体中的新CRISPR系统，有望带来基因编辑新革命

撰文 | 木兰之枻

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以CRISPR-Cas系统为基础的基因编辑工具让相关研究领域有了革命性的突破。目前而言，DNA靶向的工具中，CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12a（Cpf1）应用最为广泛。不过现有工具依然存在诸多不足之处，其中，Cas蛋白的体积过大更是严重限制了其应用（SpCas9:1368氨基酸；SaCas9：1053氨基酸；Cas12a：1353氨基酸；Cas12b：1108氨基酸；）。

长期以来，研究者多在细菌中探寻新的CRISPR-Cas系统。2016年，Jennifer Doudna实验室最先在古细菌中找到了新型的CRISPR-CasX及CRISPR-CasY系统，其拥有更小的体积（CasX：986氨基酸）并具有编辑细菌及人类细胞基因组的能力【1,2】（详见BioArt报道：Nature长文丨Jennifer Doudna等报道新型CRISPR基因编辑工具）。这一发现让研究者意识到，CRISPR-Cas系统的存在或许更加广泛。

2020年7月17日，来自加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna实验室又有新发现，他们在Science发表题为CRISPR-CasΦ from huge phages is a hypercompact genome editor的论文。文章通过对巨型噬菌体的宏基因组数据进行挖掘，结果发现一类更加小巧的CRISPR-CasΦ（Cas12j）系统（700-800氨基酸），新系统不仅结构独特，且在人源细胞和植物细胞中具有可观的基因编辑能力，这为基因编辑工具的研发提供了新的可能。

继古菌中通过数据挖掘发现的CRISPR-CasX/Y系统后，巨型噬菌体的宏基因组又带来新的惊喜，其编码的CRISPR-CasΦ系统更加小巧。从进化关系而言，CasΦ或许更为“古老”，其与V型CRISPR-Cas蛋白的同源性不足7%，但与V型CRISPR-Cas蛋白的源头TnpB核酸酶超家族的部分蛋白有更高同源性。研究发现，CasΦ借助于单一向导RNA的引导，并依赖于PAM位点的指引以实现目标DNA的识别（其中CasΦ-2所识别的PAM序列为5’-TBN-3’（B=G,T,C））。

随后的体外功能实验证实，CasΦ依赖于C末端的RuvC功能域切割双链DNA，其切割非靶链（NTS）的速度较靶链（TS）更快。研究还发现，CasΦ可通过顺式或反式作用靶向并切割单链DNA（ssDNA），这一特性在核酸检测研究中极具潜力（详见BioArt报道：Nature | 快速、准确、经济：CRISPR技术在疾病检测中的崛起）。随后的研究还发现，CasΦ可通过其RuvC功能域完成pre-crRNA的加工，这一特性迥异于其他V型CRISPR-Cas系统，它们或依赖于非RuvC功能域，或需借助于额外的III型核糖核酸酶完成pre-crRNA的加工。

之后，研究者在EGFP稳定转染的HEK293细胞系中证实，CasΦ-2和CasΦ-3均具有可观的基因编辑能力，其中CasΦ-2在部分位点对EGFP的编辑效率可达33%。此外，植物原生质体中的实验证实，通过核糖核蛋白复合物进行转染时，CasΦ-2对拟南芥的PDS3基因亦具有相当的编辑能力。

总体而言，本研究在巨型噬菌体中发现了更为小巧的CRISPR-CasΦ系统，并在人源细胞系和植物细胞中表现出可观的基因编辑能力；这一新系统的发现让CRISPR相关的工具库更加多样化，也让基因编辑工具的未来发展及应用有了更多可能。

原文链接

https://science.sciencemag.org/content/369/6501/333

参考文献

1.Burstein D, Harrington LB, Strutt SC, Probst AJ, Anantharaman K, Thomas BC, et al. New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes. Nature. 2017;542(7640):237-41.

2.Liu JJ, Orlova N, Oakes BL, Ma E, Spinner HB, Baney KLM, et al. CasX enzymes comprise a distinct family of RNA-guided genome editors. Nature. 2019;566(7743):218-23.